Madeline Lancaster曾是研究人類大腦發(fā)育和小腦畸形發(fā)病根源的博士后，她和她的實驗室研究人員面臨著類似的問題。例如，小鼠大腦并不像一個微型人腦一樣運轉(zhuǎn)和發(fā)育，而大腦內(nèi)復雜的層級網(wǎng)絡也并不是由那些在實驗室培養(yǎng)皿底部生長的神經(jīng)干細胞進化產(chǎn)生的。
她真正需要的，是一個可以在實驗室中培養(yǎng)和調(diào)控的小型器官。在2013年，Lancaster開發(fā)了一種技術(shù)來實現(xiàn)這個目標：她從人類誘導多能干細胞（IPS）中培育出了腦瀑樣組織[1]。這項技術(shù)的關(guān)鍵是選擇神經(jīng)干細胞，并將其植入一種由多種蛋白質(zhì)組成的凝膠中，這些蛋白質(zhì)通常是在細胞周圍的強化區(qū)和滋養(yǎng)區(qū)中發(fā)現(xiàn)的。通過仿造這個被稱為“細胞外基質(zhì)”（ECM）的區(qū)域，可以培養(yǎng)干細胞在3D空間中生長。這些細胞自發(fā)地發(fā)育成與煮熟的蛋清相似的小型大腦，同時具有了胚胎人類大腦的特定分層和組織特征。
Lancaster目前在位于英國劍橋的醫(yī)學研究委員會分子生物學實驗室（Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology）工作，是一個科研團隊的負責人，她介紹說他們正在為細胞提供3D培養(yǎng)的基質(zhì)，從而激發(fā)他們的自組裝本能。她的小組進一步簡化了該流程，用她的話說就是 “在任何標準的組織培養(yǎng)實驗室中都能產(chǎn)生腦瀑樣組織” 。
通常為了進行科學研究，實驗室中的傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)方法往往依賴于永生化的腫瘤細胞系，但是這些細胞系的使用會伴隨一些比較嚴重的問題，即在實驗室中通過多年的傳代而積累的突變和來自其他細胞類型的污染。此外在平整堅硬的塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)得到的細胞常常還會表現(xiàn)的很奇怪，比如最大程度的偏平化拉伸生長。
新澤西紐瓦克有一家專門研究3D細胞培養(yǎng)試劑的生物科技公司，叫做TheWell Bioscience。他們公司的總裁兼首席執(zhí)行官John Huang表示：“許多備選藥物在2D培養(yǎng)中已經(jīng)取得了成功，因為細胞形態(tài)是平的，故而容易受到藥物的攻擊。但一旦它們進入動物體內(nèi)，藥物就會失效，因為2D和3D環(huán)境中的作用機理是不一樣的。”他同時還表示，許多細胞生物學家想要的是可以對各種各樣的患者細胞（健康細胞和疾病細胞）進行培養(yǎng)的方法，并且使它們可以像在體內(nèi)原位一樣生長，甚至形成多層和多細胞組織。
當然，3D細胞培養(yǎng)也并非沒有挑戰(zhàn)。在科羅拉多大學波德分校（University of Colorado Boulder）工作的生物工程師Kristi Anseth是一個研究小組的負責人，她表示：“當你將細胞放入3D環(huán)境中時，很難對它們進行成像或免疫染色來查看某些蛋白質(zhì)是否存在，也很難在培養(yǎng)它們后重新捕獲這些細胞。”
但是Anseth自己和整個領(lǐng)域同行的直覺告訴她，3D培養(yǎng)對生物學更有意義，因為我們身體中的絕大多數(shù)細胞都是這樣生長的。目前許多公司也已經(jīng)涉足該領(lǐng)域，目的就是為了使3D細胞培養(yǎng)以及下游的細胞成像和檢測更加簡便。
關(guān)注細胞支架
任何方式的3D細胞培養(yǎng)的第一步都是把細胞從硬塑料上取下來，放到更舒適的地方。Matrigel被稱作3D細胞基質(zhì)中的“貴婦”，它是30多年前由美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）的內(nèi)部研發(fā)人員開發(fā)的動物源性基質(zhì)，開始用于3D細胞培養(yǎng)和腫瘤細胞入侵研究，后來被Corning公司商業(yè)化。它來自富含ECM蛋白質(zhì)（如層粘連蛋白，膠原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖和許多生長因子）的小鼠肉瘤。如此豐富的ECM蛋白質(zhì)對研究人員來說是一種饋贈，Lancaster的神經(jīng)干細胞在這個支架上生長時就感覺賓至如歸。但是由于在實驗中引入了未知的生物成分，也成為了一種限制。同時，Matrigel也必須依靠冷藏來保持液態(tài)，在10℃時就會開始形成凝膠，所以實驗過程都要求在冷室中進行。
位于馬薩諸塞州波士頓的Corning Life Sciences公司的副總裁兼總經(jīng)理Richard Eglen表示，在Matrigel中加入合適的生長因子后，許多細胞茁壯成長，例如肝細胞可以發(fā)育成肝臟瀑樣組織。Eglen說：“Matrigel幾乎領(lǐng)先于那個時代，在很多情況下，你會得到正確分化的細胞，它們就像在體內(nèi)一樣開始自我組織。”
TheWell Bioscience公司提供了一種比Matrigel更易于使用的極簡版水凝膠。非動物來源的多糖VitroGel 3D在室溫下是穩(wěn)定的，只有添加了含有鈣或鈉離子的培養(yǎng)基時，才開始聚合成凝膠。Huang說典型的水凝膠只需要10~15分鐘就能形成，混合步驟也十分簡單。
VitroGel 3D可作為一種柔軟的2D涂層，亦可用作嵌入細胞的3D基質(zhì)，或作為動物研究的注射劑。它的二代產(chǎn)品叫做VitroGel 3D-RGD，含有可以與大多數(shù)粘附性細胞的表面結(jié)合的位點。Huang介紹說，讓研究人員知道VitroGel 3D不含任何不必要的生物成分是一個額外的賣點。研究人員可以調(diào)整培養(yǎng)基的成分來構(gòu)建一種水凝膠，這種水凝膠可以包含他們想要的任何配體或生長因子，以影響其中的細胞。
位于瑞士巴塞爾的Lonza Bioscience Solutions公司的Lubna Hussain是負責原代細胞和3D細胞培養(yǎng)產(chǎn)品的高級產(chǎn)品經(jīng)理，他建議研究人員“要知道你的最終目標是什么，并且在3D細胞培養(yǎng)工作中使用逆向思維。”Lonza的RAFT（Real Architecture For 3D Tissue）3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含了大鼠膠原蛋白，這些膠原蛋白是在凝膠過程中支撐細胞的介質(zhì)，同時以24或96孔吸收劑來濃縮膠原蛋白。將細胞與膠原蛋白和膠凝劑混合后，置于培養(yǎng)基頂部的吸收劑會吸收過量的膠原蛋白。最終的結(jié)果是形成一個嵌有細胞的“隱形眼鏡狀結(jié)構(gòu)”，這一過程大約需要一個小時的時間來完成。Hussain說RAFT系統(tǒng)創(chuàng)造了一個高密度的環(huán)境，即每毫升體積內(nèi)的膠原蛋白高達80毫克，這更接近于體內(nèi)細胞周圍的ECM環(huán)境。
RAFT系統(tǒng)允許研究人員建立各種類型的培養(yǎng)方法，將細胞嵌入基質(zhì)中，在凝膠基質(zhì)的頂部分層進行侵襲實驗，或兩者兼而有之。研究人員可以通過插入工具來建立包含氣液界面的3D細胞培養(yǎng)模型，例如皮膚或呼吸道上皮細胞。Hussain介紹說研究人員已經(jīng)開始創(chuàng)造性地建立共培養(yǎng)模式來將癌細胞嵌入到一個薄片中，然后將免疫細胞分層排列在薄片上，以研究它們是如何滲透到腫瘤內(nèi)的。
幾何結(jié)構(gòu)意義重大
有時候研究人員會希望細胞在3D環(huán)境中生長，同時仍兼具在液體中培養(yǎng)細胞時的便利性。微載體的出現(xiàn)使得這個問題得以改善，可以做到兩全其美。Global Cell Solutions是一家提供3D細胞培養(yǎng)工具和細胞檢測方法的公司，該公司利用全局性真核細胞微載體（GEM）系統(tǒng)在直徑75到150微米的藻酸鹽磁珠表面進行高密度細胞培養(yǎng)。這些光學透明的球體可以像水一樣進行抽取而且內(nèi)部含有鐵磁顆粒，以便于磁吸懸浮或在試管中收集。弗吉尼亞Charlottesville公司的聯(lián)合總裁Robin A. Felder解釋說，這些小珠上涂有“五種仿生涂層”，即纖連蛋白，明膠，膠原蛋白，Matrigel和聚賴氨酸等。
Felder說，GEM漿液“既提供了細胞懸浮培養(yǎng)所具有的各種優(yōu)勢，也會使細胞在仿生多孔表面進行定向生長”。這意味著，在GEM中生長的細胞與2D中生長的細胞不同，它們可以表現(xiàn)出在體內(nèi)才會看到的表面特征，例如人腎細胞上的大量微絨毛。Felder表示:“細胞喜歡濕軟彎曲的表面，這樣它們就不會覺得自己和身體表面分開了。”
此外，F(xiàn)elder還指出，GEM上生長的細胞在用于觀察2D培養(yǎng)細胞的傳統(tǒng)成像系統(tǒng)中很容易操作，包括電子顯微鏡和熒光共焦顯微鏡。3D磁珠為觀察細胞的側(cè)面提供了罕見的視角，通常在2D平面培養(yǎng)中細胞的這個面是很難看到的。而且增加的GEM表面積允許在擁塞的50毫升管中培養(yǎng)多得多的細胞。Felder同時補充道，Global Cell Solutions正在開發(fā)一個機器人系統(tǒng)，可以自動進行32個獨立的GEM細胞培養(yǎng)皿的護理和營養(yǎng)供給。
一個無須凝膠的體系
通常在進行其他檢測之前，要先把在基質(zhì)、凝膠或凝膠微載體上生長的細胞分離出來。這需要完全或部分溶解細胞支架，或用酶解方法將細胞剝離出來——所有的過程都可能會以某種意想不到的方式干擾細胞的生長。很多時候，研究人員希望看到他們想要的細胞在沒有支架干擾的情況下，在3D空間中生長時的表現(xiàn)是怎樣的。無支架技術(shù)帶來的好處是不引入任何物理或者化學上可能影響細胞的東西。但直到最近，無支架的3D培育技術(shù)還很棘手，而且穩(wěn)定性較差。
在無支架的3D細胞培養(yǎng)中，細胞與相鄰的細胞相互連接，開始形成自己的原生ECM，并形成一個細胞球。一種主流的方法是利用重力和細胞培養(yǎng)基上的“懸滴”。另一種誘導細胞形成球體的方法是把它們鋪在特殊的“超低附著”培養(yǎng)皿中�，F(xiàn)在，技術(shù)的革新使得培育細胞球的方法較之以前變得更簡單、更穩(wěn)定、更安全，從而不再有包含珍貴細胞的懸滴丟失。
Corning的細胞球微孔板在96孔板和384孔板中提供超低附著表面和U形孔底。在自動成像的過程中，黑邊透明底的微孔板可以確保細胞球的位置和尺寸的重現(xiàn)性。
Timothy Spicer表示說，Corning孔板的使用，使得他們更加有可能在3D培養(yǎng)細胞上進行高通量篩選（HTS）以發(fā)現(xiàn)新藥。Timothy Spicer是佛羅里達州朱庇特斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute）的先導化合物鑒定（ID）部門工作，他負責管理探索生物學及高通量篩選平臺，這是一個向所有斯克里普斯研究所研究人員和外部合作者開放的公共技術(shù)平臺。
Spicer一直在與Corning公司合作完善1536孔細胞球微孔板的原型，這是最便于進行自動化高通量篩選的方式，可以實現(xiàn)小型化，而且節(jié)約成本。在一項使用HT-29結(jié)腸癌細胞系的研究中，Corning和Scripps的研究人員通過利用一個包含3300多種已知藥物分子文庫進行篩選，直接對比了在2D環(huán)境中生長的細胞和生長成球狀的細胞團。3D篩選中展現(xiàn)出效果的藥物遠遠少于2D篩選，這意味著在3D培養(yǎng)中只有很少的藥物可以產(chǎn)生與2D培養(yǎng)中同樣的細胞毒性水平[2]。
Spicer說：“在不遠的未來，我們可以取出源自患者的腫瘤細胞，將它們放入這些細胞球微孔板中，通過培育觀察并進行化合物庫篩選。在幾天之內(nèi)，就能找到對殺死癌細胞最有效的藥物。
同樣是在細胞球微孔板市場上競爭，瑞士蘇黎世的3D微組織公司InSphero擁有一套雙板系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以實現(xiàn)自動化操作，使懸滴培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑿徒M織。該公司的全球營銷總監(jiān)Randy Strube表示，細胞模型越復雜，懸滴系統(tǒng)就越適合它。在這種系統(tǒng)中，重力和自組裝會驅(qū)使微組織在富氧環(huán)境中形成。
InSphero的GravityPLUS培養(yǎng)板使懸滴變得簡單穩(wěn)定，并且很方便在96孔格式中進行轉(zhuǎn)移。通過在每個微孔內(nèi)設置一個獨特的沙漏型通道，平板可以保持懸滴的穩(wěn)定，而且可以從外界移入培養(yǎng)基或更多的細胞。一旦細胞球或3D微組織形成，就可以很容易地把它們轉(zhuǎn)移到匹配的GravityTRAP型96孔板內(nèi)。GravityTRAP是細胞球培養(yǎng)板，具有圓錐形平底孔和保證移液時不擾動細胞球的專用凸臺。該裝置使得研究人員能夠以一種可重復且小型化的方式，生產(chǎn)出無支架的復雜微組織。
更多的維度
對于那些不想花幾個月時間開發(fā)自己的3D培養(yǎng)系統(tǒng)的科研人員來說，InSphero還為藥物研發(fā)人員提供了已經(jīng)預先驗證和檢測的微組織。InSphero目前生產(chǎn)多種不同類型的微組織，主要集中在毒理學研究用的肝臟模型，糖尿病研究用的胰島，以及用于腫瘤研究的腫瘤—基質(zhì)共培養(yǎng)微組織。
無獨有偶，Hussain介紹說，Lonza的人類原代細胞將科研人員的大量時間精力從提取患者樣品并從頭進行細胞培養(yǎng)中解放出來，可以為他們節(jié)省平均6個月的時間。她同時也補充道，研究人員僅需從21種細胞類型家族中的一個中得到冷凍保存或新鮮的細胞，就可以輕松地開始進行科研工作。
Anseth表示， 3D培養(yǎng)的最終目標并不只是精確地再現(xiàn)人體的復雜性。為了解釋這一點，她利用飛行作為類比：“飛機會飛，并不是因為它們看起來像鳥，而是因為我們對飛行的機制了解得夠多。”她的觀點是，對3D環(huán)境下細胞系統(tǒng)或生命過程“足夠”了解，就有可能在生命過程出錯或促進康復的過程中進行適當?shù)母深A。
眾多公司目前正致力于器官芯片或人體芯片的設計應用，這一技術(shù)可以讓研究者在實驗室里用小型化的儀器對不同組織之間的交流進行捕獲和調(diào)控，這預示著3D培養(yǎng)的下一場科技浪潮已經(jīng)悄然來襲。研究3D結(jié)構(gòu)隨著時間或不同的生長因子增減過程的生長和改變（也被稱為“4D細胞培養(yǎng)”），將會帶來可能加速康復或打破退行性進程的新發(fā)現(xiàn)。
Hussain說，研究人員對3D細胞培養(yǎng)技術(shù)的選擇就像在雜貨店里挑選麥片一樣，口味不同，選擇自然不同。她建議研究人員首先從他們想要回答的問題開始，然后逆向思考，以選擇最合適的技術(shù)。就像她說的：“問題是，你使用3D培育技術(shù)的具體應用和目標是什么?”■
引用文獻：
[1] Lancaster, M. A. et al., Nature 501, 373~379 （2013）.
[2]Madoux, F. et al., SLAS Discovery （2017）， doi: 10.1177/ 2472555216686308.
（譯者李楠是中國科學院深圳先進技術(shù)研究院副研究員。）
Kendall Powell是美國科羅拉多州拉法葉的自由撰稿作者。
DOI: 10.1126/science.opms.p1700114
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發(fā)布在2017年4月24日《科學》雜志”。官方英文版請見http://www.sciencemag.org/features/2017/04/adding-depth-cell-culture。